Du couteau suisse CRISPR-Cas en 2019 … à une boîte à outils très fournie aujourd’hui
Les nouveautés technologiques pour l’édition génétique chez les plantes :
une avalanche au cours de ces 2 dernières années !
La découverte du système CRISPR-Cas en 2012 (1) par Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier leur a valu le Prix Nobel de Chimie en 2020. Depuis, les réalisations d’édition sur différents génomes (mammifères, cellules humaines, champignons, bactéries, plantes), les innovations technologiques ont été très nombreuses. Ces deux dernières années, de multiples améliorations ont vu le jour, et des technologies s’affranchissant du système initial CRISPR ont été mises au point.
L’objet de ce dossier est de détailler ces dernières découvertes, et de livrer ainsi le panorama des opportunités qui s’offrent aussi bien aux chercheurs du monde académique qu’à ceux travaillant dans des entreprises de création variétale et/ou de biotechnologies. Nous visiterons tout d’abord les améliorations des capacités des nucléases de type CRISPR-Cas, ensuite nous examinerons de nouvelles approches faisant appel à des enzymes du métabolisme des acides nucléiques, puis étudierons les nouveaux systèmes d’édition génomique basés sur les mécanismes de transposition génétique. Nous évoquerons enfin les dernières approches sur les systèmes de transfert aux cellules végétales des machineries d’édition afin de maximiser les capacités de mutagénèse dirigée chez plus d’espèces végétales et aussi sur plus de matériel d’origines génétiques diverses dans chaque espèce.
Encore des améliorations de la protéine Cas
Outre les nombreuses recherches de protéines Cas dans la biodiversité des génomes microbiens, la fin des années 2010 et début 2020 a vu différents travaux d’ingénierie des protéines Cas pour diminuer la contrainte des sites de quelques bases pour que la nucléase se fixe, appelé sites PAM (la suite de 3 bases NGG pour la nucléase Cas9 et 4, TTTN pour Cas12a) et ainsi permettre de cibler plus aisément les différentes zones d’un gène. Des réalisations avec des variants qualifiés de « PAM less » ont vu le jour (2), notamment le variant SpRY Cas9. Toutefois, l’utilisation de ce dernier est limitée pour des applications industrielles chez les plantes car une licence exclusive a été octroyée. Récemment, l’équipe de Jennifer Doudna (3) a amélioré la protéine Cas9 d’une bactérie thermorésistante Geobacillus stearothermophilus par la création de 3 mutations dans le domaine WED (wedge domain qui accélère le déroulement de l’ADN cible et facilite la reconnaissance via l’ARN guide) et le variant iGeoCas9 tolère des sites PAMs beaucoup moins stricts (Figure 1). De plus, cette découverte ouvre la porte à de nouvelles optimisations sur d’autres protéines Cas en ciblant le domaine WED.
Figure 1 : Découverte et amélioration d’une nouvelle protéine Cas9 provenant d’une bactérie thermorésistante (Eggers et al, Cell, 2024 ; référence 3)
Des orthologues à la protéine Cas9 de plus petite taille ont été activement recherchés depuis une décennie, et le sont encore, afin de permettre l’édition via des systèmes de transfert génétique transitoire ou stable accommodant la plus petite machinerie d’édition possible. Guo et al (4) ont développé par génie génétique un variant dérivé de la protéine Cas7 du système CRISPR-Cas d’une souche de Moraxella osloensis qui se révèle très efficace et qui est 1,5 fois plus petite que Cas9. Cette nouvelle Cas se prête parfaitement à la technologie du Base Editing (cf partie à suivre) comme les auteurs l’ont montré chez des cellules humaines.
Dernières optimisations et créations basées sur la protéine Cas fusionnée avec d’autres enzymes
Quelques années après la découverte de l’enzyme Cas, diverses équipes se sont attachées à supprimer ses capacités de clivage de l’ADN (créant ainsi des « dead Cas » ou « nickase ») et à rajouter des nouvelles activités enzymatiques pour modifier l’ADN. Les réalisations les plus notables ont été accomplies par les équipes de David Liu, qui ont d’abord inventé le Base Editing via l’addition d’une activité cytosine désaminase pour changer la base C en T, ou adénosine désaminase – A en G- (5). Bien que ces technologies aient déjà été beaucoup employées aussi bien chez les cellules de mammifères et humaines que chez les plantes, elles ont des contraintes ; en particulier en ne permettant pas l’édition de n’importe quelle base d’un gène y compris dans sa région codante. Des améliorations sont toutefois en cours, y compris sur la taille des protéines Cas fusionnées aux activités désaminase (4).
Les promesses du Prime Editing et ses dernières améliorations
En 2019 Andrew Anzalone, travaillant dans l’équipe de David Liu, rapporta l’invention du Prime Editing (6). Les experts du Gene Editing y virent une nouvelle révolution technologique permettant n’importe quel type de modification génétique – délétion, substitution, insertion – et ce, à quasiment n’importe quelle position dans le gène cible. Cette invention, basée d’une part sur la fusion de Cas 9 avec une activité Reverse Transcriptase et d’autre part sur le développement d’ARNs guides particuliers porteurs des modifications souhaitées (les pegRNAs), permet la ré-écriture d’une zone dans un gène (Figure 2). L’équipe de David Liu en modifiant les pegRNAs a incontestablement amélioré la technologie chez les cellules de mammifères et humaines. Chez les plantes, l’application de cette découverte importante donne toutefois du fil à retordre à bien des équipes de recherche.
Figure 2 : Illustration des technologies de Base Editing et Prime Editing découvertes par David Liu et ses équipes) (Li et al, 2024, Nature Reviews Genetics, référence 32)
Fin 2024, une équipe coréenne obtient un bon niveau d’édition prime chez Arabidopsis et la tomate en modifiant divers composants du système (7), et ils démontrent même des possibilités de multiplexage permettant l’édition de plusieurs gènes à la fois. Pour améliorer le Prime Editing chez le riz, un groupe chinois a testé des nouveaux domaines de Reverse Transcriptase incluant des modifications de celui du rétrotransposon Tf1 de levure qui leur a donné de bons niveaux d’édition (8). La découverte d’un facteur cellulaire chez les cellules humaines codant pour une protéine se fixant à des petits ARNs, notamment sur des zones 3’ poly U s’est révélée une belle piste d’amélioration du Prime Editing chez le riz après son intégration à la protéine chimérique Cas9-Reverse Transcriptase (9).
He et al (10) démontrent que des ARNs guides rallongés exprimés par la RNA polymérase II améliorent nettement le Prime Editing dans les cellules humaines, créant ainsi l’«extended Prime Editing (exPE)». Cette avancée permet l’insertion de fragments d’ADN plus grands pour envisager de mieux traiter les maladies humaines par thérapie génique, et le Prime Editing est aussi plus efficace lorsque la cible se trouve dans des zones riches en T. Toujours chez l’humain, il ressort que la structure de la chromatine peut influer grandement sur l’efficacité du Prime Editing, et l’adaptation des guides pegRNAs en fonction des zones ciblées semble clef (11). Grâce à des prédictions par machine learning, ces chercheurs proposent des logiciels pour améliorer le PE en fonction des zones à cibler.
Ces dernières améliorations chez les cellules humaines et d’autres pistes de recherche autour du Prime Editing sont prometteuses pour l’édition génomique chez les plantes. Aussi dans le cadre du programme Ambition France 2030, le Projet PEPR TYPEX, coordonné par Fabien Nogué, s’est donné l’ambition d’améliorer le PE et de le déployer sur des espèces cultivées y compris certaines particulièrement récalcitrantes (https://anr.fr/ProjetIA-22-PESV-0002). Déjà, cette équipe a pu montrer que la stabilisation des pegRNAs par des additions en 3’, soit des epegRNAs (pour extended prime editing guide RNAs) a amélioré l’efficacité du PE chez la mousse Physcomitrium patens (12).
C’est aussi grâce au saut technologique que représente le Prime Editing que des technologies dérivées ont vu le jour pour permettre l’insertion de fragments d’ADN de grande taille, par exemple pour corriger des maladies génétiques chez l’humain, voire envisager de maîtriser plus efficacement la cis-génèse chez les plantes (insertion d’un gène existant dans le pool génétique de l’espèce). Les 2 premières : « GRAND editing » et « Twin Prime Editing » publiées en 2022 sont basées sur des pegRNAs doubles et complémentaires. Puis en 2023, la technologie PASTE a été inventée (13). PASTE, acronyme de « Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements », utilise la fusion d’une activité sérine intégrase à la protéine chimérique Cas9-Reverse Transcriptase (Figure 3).
Figure 3 : Illustrations des éléments et étapes de la technologie PASTE utilisant une activité intégrase et les sites adéquats attB. (Yarnall et al, 2023, Nature Biotechnology ; référence 12)
Ceci permet l’insertion de morceaux d’ADN nettement plus grands que les technologies qui précèdent. L’équipe de David Liu, encore elle, a produit en 2024 une nouvelle technologie dérivée du Prime Editing, PASSIGE pour « Prime-editing Assisted Site-Specific Integrase Gene Editing » (14) via l’évolution dirigée de la recombinase Bbx1 qui est fusionnée à la protéine chimérique Cas-RT ; PASSIGE semble nettement plus efficace que PASTE dans des cellules humaines. La taille des fragments insérés peut être supérieure à 10 Kilobases !
Des progrès aussi sur de nouvelles voies de mutagénèse ciblée
Des auteurs viennent de développer la technologie de « Click Editing » qui fait appel à des ADN polymérases DNA dépendantes (15) et qui, contrairement au Prime Editing qui utilise un ARN guide et la reverse transcription, met en jeu l’utilisation d’un ADN simple brin appelé « click DNA » qui est pris en charge par une activité endonucléase particulière puis sert à réécrire la zone ciblée du gène. Bien que cette technologie soit censée éviter certaines limites du Prime Editing surtout chez les cellules de mammifères, elle ne paraît pas forcément la plus prometteuse pour l’édition de gènes chez les plantes. À voir.
Si la recombinaison homologue est assez bien maîtrisée chez les cellules de mammifères, elle reste un challenge majeur chez les plantes à fleur pour des raisons encore inconnues. Ainsi les changements d’allèles au locus ou autres modifications ciblées, difficiles ou impossibles via le Base Editing ou Prime Editing, restent très délicates à obtenir. L’équipe d’Alain Tissier vient d’améliorer nettement la recombinaison homologue en fusionnant Cas 9 ou Cas12 à une activité 5’ exonucléase du virus de l’herpès, permettant ainsi l’insertion de larges fragments d’ADN ou le remplacement d’allèles aussi bien chez Arabidopsis, le tabac que chez le blé (16).
Tout récemment la technologie HACE (Helicase Assisted Continuous Editing), qui permet d’aller introduire des mutations aléatoires sur une zone ciblée du génome, a été présentée. Elle est basée sur les capacités de ciblage de CRISPR-Cas et judicieusement complétée par un complexe Hélicase- désaminase qui vient modifier la séquence d’ADN sur la zone ciblée (Figure 4). Cette capacité de créer de multiples mutations sur un locus à étudier dans un génome permet d’entrevoir une génétique très ciblée pour par exemple entreprendre des analyses structure-fonction de gènes ou de protéines, mais aussi pour créer une nouvelle variabilité génétique aussi bien sur la région codante d’un gène que dans ses zones de régulations (17).
Figure 4 : Principe de la mutagénèse ciblée via la technologie HACE (Helicase Assisted Continuous Editing) : composants en haut et étapes en bas (Chen et al, 2024, Science ; référence 16)
L’utilisation des systèmes de transposition va-t-elle révolutionner le domaine ?
Début des années 2020, certaines équipes ont commencé à coupler CRISPR-Cas avec des éléments de systèmes de transposition de divers organismes afin d’exploiter leurs propriétés d’insertion dans le génome. Un des premiers objectifs était de maîtriser des insertions de longs fragments d’ADN au locus ciblé et la technologie FiCAT (Find and cut-and-transfer) a été inventée. Elle est basée sur la fusion de Cas9 avec la transposase du système piggyBAC provenant d’un baculovirus (18), et l’addition d’une construction génétique bordée par les séquences terminales reconnues par cette transposase (aussi appelées TIR pour Terminal Inverted Repeat). De grandes insertions ont pu être obtenues dans des cellules humaines et murines, et la spécificité du système a été bien améliorée via une optimisation de la transposase par l’ajout de mutations adéquates. Pour les plantes, la fusion de la transposase Pong du transposon mPing de riz (utilisant lui aussi des TIRs) à la nucléase Cas9 ou Cas12 (19), a permis entre autres de maîtriser l’insertion d’éléments activateurs dans les promoteurs de gènes ciblés chez Arabidopsis et le soja ; et aussi l’insertion de grands fragments, laissant entrevoir une cis-génèse efficace. Cette méthode a été baptisée : TATSI pour « Transposase Assisted Target Site Integration ».
De plus, en 2019, différentes équipes dont l’équipe de Feng Zhang, un des pionniers du Gene Editing (20) ont découvert que les systèmes d’immunité CRISPR qui protègent les bactéries contre les infections ou invasions de phages ou de plasmides, sont portés et propagés par des systèmes de transposition associés ! En fait des transposons bactériens similaires à ceux du type Tn7 ont évolué pour utiliser des systèmes Cas défectifs et promouvoir ainsi leur transposition grâce à des ARN guides. En outre, l’analyse fine de l’évolution des séquences bactériennes semble indiquer que certaines transposases pourraient être des/les ancêtres des nucléases Cas9 et Cas12 !!! Ces découvertes ont conduit ces mêmes équipes et d’autres à développer des systèmes d’édition basés sur ces « CRISPR-associated transposases » (CASTs), pour entre autres insérer des fragments d’ADN assez longs dans les génomes. Différentes améliorations ont été proposées récemment dans l’objectif d’utiliser le moins de composants possibles dans les construits génétiques et aussi d’avoir des systèmes moléculaires de petites tailles (21), ce qui a conduit certaines équipes à utiliser d’autres types de transposon, tel l’ISDra2 de Deinococcus radiodurans (22). Sa transposase TnpB a été modifiée pour obtenir une endonucléase programmable ultra compacte, offrant des promesses d’applications thérapeutiques qui fonctionnent déjà sur certains organes de souris ! Les auteurs proposent aussi un programme de machine learning pour définir un RNA guide omega optimisé pour chaque cible. La transposase d’ISDra vient d’être utilisée avec succès pour faire de l’édition chez le riz et Arabidopsis (23). La grande découverte de 2024 dans ce domaine de l’utilisation des systèmes de transposition est probablement celle de l’équipe de Patrick D. Hsu (24) : ils ont domestiqué les séquences d’insertion du type IS110 (très présentes chez les procaryotes). Ces séquences correspondent à un transposon autonome minimal produisant des ARN non codants programmables qui se fixent à leur transposase et ont la propriété de combiner de l’ADN donneur et de l’ADN receveur. Cette approche permet de créer aisément des additions, délétions ou inversions géniques de façon dirigée. Ce système de recombinaison par pontage ou – utilisant un « bRNA » pour « bridge RNA » – étend nettement la diversité des outils précédents et offre un mécanisme unifié pour programmer les 3 réarrangements fondamentaux de l’ADN – insertion, excision et inversion. Dans la publication jointe (25) ils montrent via la cryo-microscopie électronique les différentes étapes de ce nouveau mécanisme de recombinaison basé sur ces ARNs chimériques (bRNA) permettant de ponter l’ADN cible et l’ADN donneur. Impressionnant ! Cette découverte de recombinases reposant sur des ARNs ponts (Figure 5), et sa domestication semble très prometteuse pour réaliser des modifications génétiques avec de grands fragments d’ADN, toutefois il reste à démontrer que cela peut fonctionner chez des cellules eucaryotes aussi bien de mammifères et de plantes ; des optimisations seront nécessaires mais semblent tout à fait possibles (26). Attendons de voir si “l’Edition Pont” s’applique bien chez les plantes.
Figure 5 : Illustration comparant l’édition génétique ciblée basée soit sur des recombinases classiques soit sur des recombinases utilisant des ARNs ponts (Tou et al, 2024, Nature ; référence 25)
Et des voies innovantes pour délivrer la machinerie d’édition chez la majorité des plantes
Les outils de plus en plus sophistiqués décrits précédemment doivent être intégrés (même temporairement) aux cellules végétales pour réaliser toutes ses “éditions” Or les techniques de transformation génétique ne sont disponibles que pour une minorité d’espèces végétales, et même chez les espèces non récalcitrantes, elles sont souvent très dépendantes du génotype ou de la variété considérée. Cela constitue une limite très importante au développement de l’édition génétique chez les plantes. Les efforts de la communauté aussi bien côté académique que du côté industriel sont importants, et quelques belles réalisations ont vu le jour ces deux dernières années. En utilisant un ingénieur génétique naturel, Agrobacterium rhizogenes, une équipe a pu mettre au point les premières étapes clefs de l’édition chez l’amandier (26). Parallèlement, une autre équipe a utilisé le bombardement de particules pour injecter le complexe protéique Cas9 avec les ARNs guides directement dans les méristèmes apicaux de soja, et développer ainsi une méthode d’édition qui fonctionnerait chez tous les génotypes (28). Cette approche s’affranchit des problèmes de culture in vitro et de régénération de cellules.
Pour contourner l’absence de méthode de transformation stable, l’utilisation de systèmes basés sur des virus recombinants est largement travaillée, et on peut citer quatre réalisations importantes obtenues récemment. Le virus Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) infecte un large spectre d’espèces végétales. L’utilisation de ce virus comme vecteur, après délétion des parties nécessaires pour la transmission par les insectes, a permis l’introduction de la machinerie d’édition dans différentes solanacées, et même de réussir directement du base editing chez diverses espèces (29). Cela a par exemple permis d’établir des protocoles d’édition chez le poivron, une espèce particulièrement difficile à transformer (30). L’équipe de Dan Voytas, un pionnier du Gene Editing chez les plantes, a tout récemment domestiqué le Foxtail Mosaic Virus (FoMV) pour obtenir une haute fréquence d’édition du génome somatique chez le sorgho (31). Le Tobacco Rattle Virus (TRV) a été utilisé pour introduire une transposase TnpB de ISYmu1 compacte et un ARN guide chez Arabidopsis, et assurer de l’édition sans étape transgénique (32). Malgré ces innovations récentes, pour la majorité des espèces et de génotypes, il reste pas mal de travail pour mettre au point des méthodes d’édition efficaces susceptibles de transmettre les modifications génétiques à la descendance de la majorité des espèces et de génotypes.
On se doit de terminer ce chapitre en soulignant le saut technologique publié par une équipe de la société Corteva (33), qui potentialise et améliore les capacités d’édition chez le maïs en transférant la machinerie CRISPR-Cas9 via un système génétique induisant des haploïdes doublés et en évitant l’utilisation de produits chimiques nécessaires au doublement chromosomique. Une telle maîtrise technologique laisse entrevoir l’intégration de l’édition génique directement dans les programmes de création variétale.
Conclusion et enseignements
Ce dossier ne vise en aucun cas à être une revue exhaustive des travaux publiés sur toutes les technologies en édition génomique pour des applications chez les plantes, il a juste l’ambition de relater les innovations majeures qui ont marqué ce domaine au cours des deux dernières années. La revue écrite en 2024 par Caxia Gao (34), la leader de l’édition génomique végétale depuis plus de 10 ans, mérite aussi une lecture. Aujourd’hui il est clair que la boîte à outil s’est très largement étendue et dépasse nettement la vision du couteau suisse offerte par CRISPR-Cas il y a quelques années. Il est remarquable que la très grande majorité des améliorations et des innovations soient basées sur des mécanismes et systèmes biologiques naturels. De plus, quasiment toutes les technologies présentées et citées ci-dessous et ou améliorations sont brevetées par les organismes de recherche ou entreprises industrielles de leurs auteurs. Tout ceci souligne les potentialités et enjeux majeurs de l’édition des génomes pour la société, aussi bien côté science ou médecine mais aussi pour le futur des agricultures.
Références
1) Jinek et al, 2012, Science, vol 337, pp 817-821 ; DOI: 10.1126/science.1225829
2) Walton et al, 2020, Science, vol 368, pp 290-296 ; DOI: 10.1126/science.aba8853
3) Eggers et al., 2024, Cell, vol 187, pp 3249–3261 ; https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.031
4) Guo et al, 2024, Nature Communications, vol 15, 7277 ; https://doi.org/10.1038/s41467-024-51695-x
5) Gaudelli et al, 2017, Nature, vol 551, pp 464-471 ; DOI: 10.1038/nature24644
6) Anzalone et al, 2019, Nature, vol 576, pp 149-157 ; DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4
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8) Cao et al, 2024, Journal of Integrative Plant Biology, vol 66(9), pp – 1864-1870 ; https://doi.org/10.1111/jipb.13738
9) Yan et al, 2024, Nature, vol 628 , pp 639-647 ; https://doi.org/10.1038/s41586-024-07259-6
10) He et al, 2024, Trends in Biotechnology, september 21st ; https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2024.09.004
11) Mathis et al, 2024, Nature Biotechnology, june 21st 2024 ; https://doi.org/10.1038/s41587-024-02268-2
12) Perroud et al, 2023, Journal of Experimental Botany, Vol. 74 (19) pp. 6176–6187, 2023 ; DOI: 10.1093/jxb/erad189
13) Yarnall et al, 2023, Nature Biotechnology, vol 41 (4), pp 500-512 ; https://doi.org/10.1038/s41587-022-01527-4
14) Pandey et al, 2024, Nature Biomedical Engineering, June 10 2024 ; https://doi.org/10.1038/s41551-024-01227-1
15) Ferreira da silva et al, 2024, Nature Biotechnology, July 2024 ; https://doi.org/10.1038/s41587-024-02324-x
16) Schreiber et al, 2024, Molecular Plant, vol 17, pp 824-837 ; https://doi.org/10.1016/j.molp.2024.03.013
17) Chen et al, 2024, Science, vol 386, issue 6718 ; DOI: 10.1126/science.adn5876
18) Pallares-Mastmitjà et al, 2021, Nature Communications,vol 12, article 7071 ; https://doi.org/10.1038/s41467-021-27183-x
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21) Tou et al, 2023, Nature Biotechnology, vol 41, pp 968-979 ; https://doi.org/10.1038/s41587-022-01574-x
22) Fabiano Marquart et al, 2024, Nature Methods, vol 21, pp 2084-2093 ; https://doi.org/10.1038/s41592-024-02418-z
23) Karmakar et al, 2024, Plant Biotechnology Journal, short communication, June 2024 ; https://doi.org/10.1111/pbi.14416
24) Durantt et al, 2024, Nature, vol 630, pp 984-993 ; https://doi.org/10.1038/s41586-024-07552-4
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26) Tou et al, 2024, Nature, vol 630 , pp 827-828
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28) Kuwabara et al, 2024, Plant Physiology, vol 196, pp 2320-2329 ; https://doi.org/10.1093/plphys/kiae491
29) Liu et al, 2023, Molecular Plant, vol 16, pp 616-631 ; https://doi.org/10.1016/j.molp.2023.02.003
30) Zhao et al, 2024, Journal of Integrative Plant Biology, Brief communication, June 2024 ; https://doi.org/10.1111/jipb.13741
31) Baysal et al, 2024, The Plant Journal, Technical advance, December 2024 ; DOI: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.17196
32) Weiss et al, 2024, BioXriv ; https://doi.org/10.1101/2024.07.17.603964
33) Ye et al, 2024, Nature Plants, vol 10, pp 1493-1501 ; https://doi.org/10.1038/s41477-024-01795-9
34) Li et al, 2024, Nature Reviews Genetics, vol 25, pp 603–622 ; https://doi.org/10.1038/s41576-024-00720-2
Rédaction Pascual Perez, AFBV
Remerciements à :
- Fabien Nogué pour son aide très précieuse pour identifier la littérature scientifique récente pertinente, et pour sa relecture attentive
- David Bouchez, Christophe Robaglia, Thierry Langin et Thierry Hardy pour leur relecture et correction du manuscript
